基因編輯近年來廣受歡迎，使得科學(xué)家們可對基因進(jìn)行簡單“操控”。但多年來，這一技術(shù)一直缺少一個能隨時開啟或關(guān)閉的按鈕?，F(xiàn)在，我國科學(xué)家終于為“基因剪刀”創(chuàng)建了可行的光控開關(guān)——
通過感光元器件實現(xiàn)對事物的控制，“光控”在現(xiàn)實生活中已慢慢普及，例如手機(jī)人臉識別解鎖、汽車霧燈自動開啟……這次被光操控的是基因編輯。我國科學(xué)家的這一研究成果近日發(fā)表在《科學(xué)·進(jìn)展》雜志上。
“LED發(fā)出的730nm（納米）的遠(yuǎn)紅光可激活系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯工作。”論文通訊作者、華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院、醫(yī)學(xué)合成生物學(xué)研究中心研究員葉海峰對科技日報記者表示，只有在光照到的地方，基因的“編輯”“剪切”才會發(fā)生，從而真正做到指哪剪哪。
圖源：圖蟲創(chuàng)意
創(chuàng)建關(guān)鍵元件 為基因編輯裝上自動開關(guān)
CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)近年來應(yīng)用廣泛，被形象地稱為“基因剪刀”，使得人類掌握了簡便可行的基因“操控術(shù)”。
然而，要更便捷地操控基因編輯，需要一個“便捷按鈕”，讓人們按一下就能啟動，再按一下就能關(guān)閉，推動其走進(jìn)“自動化時代”。尤其當(dāng)基因編輯要走進(jìn)臨床應(yīng)用，必須要具有靈活、高精度的操控方法，才能使其更具安全性。
“實現(xiàn)光控”需要在基因編輯前裝一個“光感裝置”用于“引爆”，這個裝置長什么樣子？有哪些零件？
在紅細(xì)菌中有一種蛋白BphS，它在接收到遠(yuǎn)紅光的信號后會被激活，釋放一個信號。而在放線菌里的蛋白BldD，接收到這個信號后能與DNA序列結(jié)合。
“我看到這個信息的時候，覺得非常興奮。前一種蛋白讓光和生物體‘接上頭’，后一種蛋白又‘鏈接’上了DNA。”葉海峰說，這種“跨界打通”意味著有很多工作可做，因為只要信號能傳導(dǎo)到DNA，就能推進(jìn)生物學(xué)的操控。
葉海峰團(tuán)隊以放線菌中的BldD蛋白為基礎(chǔ)，將其親和DNA序列與哺乳動物的轉(zhuǎn)錄激活子融合，創(chuàng)制了一個雜交型的轉(zhuǎn)錄激活子，這一開關(guān)成為按下基因編輯“啟動鍵”的關(guān)鍵元件。
這一元件的前方設(shè)置了光敏蛋白，接收光信號；后方連接上“基因剪刀”Cas9核酸酶。這個巧妙的設(shè)計使得整個系統(tǒng)只有感光后，才能夠啟動基因編輯。光控基因編輯的“圖紙”就此設(shè)計完成。
驗證上百種序列 拼出遠(yuǎn)紅光操控的編輯系統(tǒng)
理論“圖紙”和關(guān)鍵元器件都已準(zhǔn)備就緒，葉海峰團(tuán)隊開始用合成生物學(xué)的方法對這些關(guān)鍵元器件進(jìn)行組裝。
令人意想不到的是，在細(xì)胞水平的驗證中，基因編輯并沒有因為光的有無而產(chǎn)生明顯的變化，遠(yuǎn)紅光照射沒能刺激Cas9核酸酶的高量表達(dá)，熄滅光源也沒有阻止基因編輯工作。
問題出在了哪里？按照“圖紙”設(shè)計，整個流程應(yīng)該是無懈可擊的。
葉海峰百思不得其解。“這一研究工作我們持續(xù)推進(jìn)了5年，有的關(guān)鍵性問題如果不能解決將會耽誤整個研究的進(jìn)展。”葉海峰說，合成生物學(xué)要在活體內(nèi)運轉(zhuǎn)，會有很多無法排查的意外。它不像編程，跑一遍會有糾錯，或者至少會提示哪個部分出現(xiàn)“BUG”。
這次的“BUG”出現(xiàn)在哪里？啟動基因的工作被相繼驗證。2017年、2018年，葉海峰課題組在《科學(xué)·轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)》《美國科學(xué)院院刊》相繼發(fā)表論文，證明了遠(yuǎn)紅光調(diào)控轉(zhuǎn)基因表達(dá)控制系統(tǒng)的可行性以及基因編輯CRISPR-dCas9酶的轉(zhuǎn)錄激活都是可行的。
“我們試驗了各種方案，但整個系統(tǒng)的運行卻都失敗了。”葉海峰說，這個結(jié)果意味著需要對策略進(jìn)行根本性的調(diào)整。
直到有一天，葉海峰在《自然·生物技術(shù)》上看到一篇張鋒（基因編輯技術(shù)發(fā)明人之一）的文章，上面說基因編輯的Cas9核酸酶可以一拆為二，拆開來之后的兩半再合起來也是有功能的。
“受到這樣的啟發(fā)，我們就想可不可以把它拆成兩半，一半是連續(xù)的強(qiáng)表達(dá)（自始至終一直表達(dá)），另一半用光驅(qū)動調(diào)控來表達(dá)。”葉海峰說，就像“鑰匙”的兩半拼在一起才能開鎖一樣。
“拼”這個動作又要怎么自動實現(xiàn)呢？葉海峰想到了熱纖維梭菌中的一對能夠自發(fā)相互結(jié)合的蛋白Coh2和DocS。讓它們加入進(jìn)來，分別與Cas9的兩部分融合，Coh2和DocS就會像“磁石”一樣，將Cas9的兩部分拼裝成完整、有功能的Cas9核酸酶。
“究竟是哪一半用光來調(diào)控誘導(dǎo)表達(dá)，都是有說法的。”葉海峰回憶，課題組對多種情況進(jìn)行了試驗，至少進(jìn)行了上百種不同序列的驗證，以尋找最佳光控基因編輯效果。
“我們還對整個系統(tǒng)進(jìn)行了優(yōu)化，例如質(zhì)粒的濃度配比，核輸入信號和核輸出信號的選擇及組合等，并在細(xì)胞水平進(jìn)行了測試。”葉海峰說，經(jīng)過嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膬?yōu)化，實驗結(jié)果最終令人滿意，并將其命名為“FAST系統(tǒng)”。
研究結(jié)果顯示，F(xiàn)AST系統(tǒng)在LED發(fā)射的低強(qiáng)度遠(yuǎn)紅光照射下可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的基因編輯，而在黑暗情況下保持“靜默”的效果也很好。
進(jìn)一步研究表明，F(xiàn)AST系統(tǒng)在多種細(xì)胞中均顯示出可調(diào)控的基因編輯效果，并具有很好的光照強(qiáng)度和時間依賴性，以及高度的時空特異性，為研究FAST系統(tǒng)在動物體內(nèi)的可調(diào)控基因編輯能力奠定了基礎(chǔ)。
“我們至今也不太清楚為什么直接調(diào)控表達(dá)完整Cas9核酸酶的系統(tǒng)不成功。”葉海峰說，不按程序走，這就是生命科學(xué)的神奇之處，而合成生物學(xué)正是在破解這些意外中積累起來，最終解決更大的科學(xué)命題。
光照時間太長 活體高效遞送還需“打怪升級”
生命體是復(fù)雜的，在細(xì)胞水平運轉(zhuǎn)良好的系統(tǒng)在活體中能不能工作，仍面臨著重重挑戰(zhàn)。為此，在進(jìn)行了細(xì)胞驗證后，研究團(tuán)隊還進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因報告模型小鼠和腫瘤模型小鼠的驗證工作。
“讓整個系統(tǒng)在活體中工作，會遇到新的問題，比如遞送的問題。”葉海峰解釋，F(xiàn)AST系統(tǒng)由好幾個質(zhì)粒組成，它們進(jìn)入細(xì)胞比較簡單，但能不能突破重重阻礙進(jìn)入到組織細(xì)胞里面呢？比如高效遞送到肝臟和腫瘤組織里面，就需要借助于遞送系統(tǒng)，而且遞送的效率直接決定整個系統(tǒng)的工作效率。
“研究推進(jìn)時，遞送技術(shù)是又一個難題，我們最初直接通過靜脈注射，效果卻不是那么好。”葉海峰說，“細(xì)胞中工作的質(zhì)粒在進(jìn)入活體的時候受到了阻礙，因為整個系統(tǒng)承載的元件太多，所有元件同時遞送的效率不能保證，且質(zhì)粒會被機(jī)體認(rèn)為是外來物而被清除掉。”
想進(jìn)入活體，整個系統(tǒng)還需要再調(diào)整。“這就好比原來坐的卡車太大了、目標(biāo)明顯，需要換乘一個‘特洛伊木馬’潛進(jìn)去。”葉海峰說。
研究團(tuán)隊后來在合作團(tuán)隊的幫助下，使用另一種更小的、能夠整合進(jìn)細(xì)胞里的質(zhì)粒進(jìn)行遞送工作。實驗結(jié)果中，轉(zhuǎn)基因小鼠在肝臟部位顯示出了基因編輯的報告情況，表明小鼠肝臟細(xì)胞中DNA可通過光控編輯。
實體瘤是比組織器官更致密的組織，進(jìn)入其中則需要進(jìn)一步升級遞送系統(tǒng)。
“為了把FAST系統(tǒng)高效遞送到腫瘤組織細(xì)胞里面，我們與浙江大學(xué)專門制作DNA分子遞送的團(tuán)隊合作，用納米技術(shù)合成的材料實現(xiàn)了向腫瘤組織的高效遞送。”葉海峰說。
在腫瘤小鼠模型中的驗證結(jié)果顯示，將FAST系統(tǒng)遞送至小鼠體內(nèi)的腫瘤后，通過遠(yuǎn)紅光LED的照射，F(xiàn)AST系統(tǒng)能切割腫瘤致癌基因，從而顯著抑制腫瘤的生長。
再好的技術(shù)只有走進(jìn)應(yīng)用才能實現(xiàn)價值。“之所以希望實現(xiàn)光控，初心就是希望推進(jìn)廣泛的應(yīng)用。”葉海峰說，實驗也證明了遠(yuǎn)紅光可以透過小鼠的皮膚進(jìn)入到小鼠的肝臟內(nèi)部，甚至進(jìn)入到實體瘤內(nèi)部。這意味著FAST系統(tǒng)有疾病治療的應(yīng)用潛力。
葉海峰表示，團(tuán)隊仍在進(jìn)一步優(yōu)化光控基因表達(dá)系統(tǒng)，例如現(xiàn)在的光控系統(tǒng)需要光照2小時才能工作，而未來希望得到改進(jìn)后，照射幾秒就能產(chǎn)生效果。
來源：科技日報
